Fluoreszenzlebensdauer

Die Fluoreszenzlebensdauer $ \tau $, früher auch Fluoreszenzabklingzeit, gibt die mittlere Zeit an, die ein Molekül bei der Fluoreszenz in einem angeregten Zustand bleibt, bevor es ein Photon emittiert und damit in den Grundzustand zurückkehrt.

Typische Fluoreszenzlebensdauern liegen in der Größenordnung von 10⁻⁹ bis 10⁻⁷ s. Dabei ist zu beachten, dass es sich bei der Fluoreszenz um einen spinerlaubten Vorgang handelt. Bei der spinverbotenen Phosphoreszenz dagegen ergeben sich um Größenordnungen längere Lebenszeiten im Bereich von Millisekunden bis Stunden.

Bedeutung

Die Fluoreszenzlebensdauer ist in der Spektroskopie und Mikroskopie (Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie) ein wichtiger Messparameter, der zur Unterscheidung verschiedener (auch gleichfarbiger) Fluorophore dient. Darüber liefert die Fluoreszenzlebensdauer wichtige Informationen über die chemische Umgebung eines Fluorophors und kann Energietransfermechanismen, wie den Förster-Resonanzenergietransfer, aufdecken.

Zum Beispiel wird in einer Zelle die Fluoreszenzlebensdauer durch die nähere Umgebung des Fluorophors beeinflusst, d. h. die Fluorophore können als Messsonden der Umgebung dienen.

Definition

Der Zerfall der Fluoreszenz folgt dabei einem exponentiellen Gesetz:

$ I(t)=I_{0}\exp \left(-{\frac {t}{\tau }}\right) $.

mit

• der Fluoreszenzintensität $ I_{0} $ unmittelbar nach einem Anregungsblitz (z. B. einem Laserimpuls)
• der verstrichenen Zeit $ t $.

Für die Fluoreszenzlebensdauer gilt

$ \tau ={\frac {1}{k_{\mathrm {r} }+k_{\mathrm {nr} }}} $

mit

• der Rate $ k_{\mathrm {r} } $, mit der strahlende Prozesse zerfallen (engl. radiative)
• der Rate Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{nr} , mit der nicht-strahlende Prozesse zerfallen (engl. non-radiative).

Bei stark fluoreszierenden Stoffen wie Fluoreszenzfarbstoffen ist Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{nr} verschwindend gering:

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{r} \gg k_\mathrm{nr} \Rightarrow \tau \approx \frac 1 {k_\mathrm{r}}

Bei nicht-fluoreszierenden Stoffen hingegen (also den meisten Dingen unserer Umgebung) ist Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{r} viel kleiner als Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{nr} :

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): k_\mathrm{r} \ll k_\mathrm{nr} \Rightarrow \tau \approx \frac 1 {k_\mathrm{nr}}

Experimentelle Bestimmung

Die Ermittlung von Fluoreszenzlebensdauern erfordert die zeitaufgelöste Aufzeichnung der Intensität der emittierten Strahlung.

Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung

Ein gängiges Verfahren dafür ist die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC). Dabei erfolgt die Anregung der Probe periodisch mit monochromatischen Lichtblitzen geringer Intensität (Laser, Nanosekunden-Blitzlampe, Monochromator auf Emissionsseite der Versuchsanordnung). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt bei einer Wellenlänge, die größer ist als der zur Anregung verwendete, mit einem Sekundärelektronenvervielfacher (Photomultiplier / PMT), der einzelne Photonen registrieren kann. Wird das Licht der Anregungslichtquelle so stark abgeschwächt, dass nur noch nach ein bis fünf Prozent der Lichtblitze ein Signal registriert wird, so kann davon ausgegangen werden, dass es sich um die Registrierung einzelner Photonen handelt.

Mit einer elektronischen Schaltung werden Zeitmessungen durchgeführt, die von einem zusätzlichen Detektor (Photodiode) direkt an der Lichtquelle gestartet und vom Signal des Fluoreszenzdetektors gestoppt werden. Durch die Diskretisierung des Zeitsignals erhält man nach Durchlaufen vieler Anregungs-/Mess-Zyklen ein (von der Auflösung der eingesetzten Analog-Digital-Wandlers abhängiges) Histogramm (siehe Abbildung). Seine Einhüllende entspricht dem Signal einer analogen Aufzeichnung des zeitaufgelösten Intensitätsverlaufs der Fluoreszenz nach einem einzelnen Anregungsimpuls hoher Leistung. Aus dem Histogramm kann die Fluoreszenzlebensdauer $ \tau $ graphisch oder durch Regressionsanalyse ermittelt werden.

Phasenfluorometrie

Eine andere Methode ist die Messung im Frequenzbereich (Phasenfluorometrie). Hierbei wird die Probe mit einem Licht Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): E(t) bestrahlt, dessen Intensität mit der Kreisfrequenz Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \omega moduliert wird (Formelzeichen E wie engl. excitation: Anregung). Detektiert wird das emittierte Fluoreszenzlicht Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): F(t) , das mit der gleichen Frequenz, jedoch verringerter Amplitude moduliert ist. Es tritt eine Phasenverschiebung auf.

Das System lässt sich als eine lineare Antwortfunktion beschrieben:

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \begin{align} F(t) &= \chi(\omega) \, E(t)\\ &= |\chi(\omega)| \, E_0\ \mathrm{exp}\left( -i[\omega t - \phi(\omega)] \right) \end{align}

mit

• der Suszeptibilität $ \chi \left(\omega \right) $, die sich aus einem Dispersions- und einem Absorptionsterm zusammensetzt
• der Phase Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \phi .

Wird nun als Antwort auf eine Delta-Störung im Zeitbereich eine Debye-Relaxation angenommen:

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \overline{\chi} \left( t \right) = \mathrm{exp} \left( -\frac t{\tau_M} \right)

mit der Abklingzeit Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \tau_M für die Demodulation,

dann folgt für den Frequenzbereich nach einer Fouriertransformation:

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \chi(\omega) = \frac{1 + i \, \omega \, \tau_M}{1 + ({\omega} \, {\tau_M})^2}

Für die Phase ergibt sich mit der Abklingzeit Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \tau_P :

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \begin{align} \phi(\omega) &= \arctan{(\omega \, \tau_P)}\\ \Leftrightarrow \tau_P &= \frac 1{\omega} \cdot \tan{\phi(\omega)} \end{align}

und für die Demodulation:

Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \begin{align} M = |\chi(\omega)| &= \sqrt{\frac 1{1 + ({\omega} \, {\tau_M})^2}}\\ \Leftrightarrow \tau_M &= \frac 1{\omega} \cdot \sqrt{\left(\frac 1 M \right)^2 - 1} \end{align}

Im Falle nur eines Fluorophors sind Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \tau_P und Fehler beim Parsen (MathML mit SVG- oder PNG-Rückgriff (empfohlen für moderne Browser und Barrierefreiheitswerkzeuge): Ungültige Antwort („Math extension cannot connect to Restbase.“) von Server „https://wikimedia.org/api/rest_v1/“:): \tau_M gleich und frequenzunabhängig: die Fluoreszenzlebensdauer.

Literatur

• Joseph R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Publishing Corporation, 2. Ausgabe, 1999
• K. Suhling et al. - Imaging the Environment of Green Fluorescent Protein, Biophysical Journal (2002) 83, 3589–3595
• Primer on Time-Correlated Single Photon Counting, PicoQuant GmbH, Berlin.