Quelltext der Seite Thermal Shift Assay

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[[Datei:Thermal Shift Assay diagram.svg|mini|400px|Prinzip des thermal shift assay]]
Ein '''{{lang|en|thermal shift assay}}''' (TSA, synonym ''{{lang|en|Thermofluor Assay}}'' oder ''{{lang|en|Differential Scanning Fluorimetry}}'', DSF) ist eine biochemische Methode zur Messung der Änderung der [[Thermostabilität]] der [[Proteinfaltung|Faltung]] eines Proteins nach Zugabe eines [[Ligand (Biochemie)|Bindungspartners]].<ref>F. H. Niesen, H. Berglund, M. Vedadi: ''The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.'' In: ''Nature protocols.'' Band 2, Nummer 9, 2007, {{ISSN|1750-2799}}, S.&nbsp;2212–2221, {{DOI|10.1038/nprot.2007.321}}, PMID 17853878.</ref> Sie ist dadurch eine Methode zur Bestimmung von [[Protein-Protein-Interaktion|Protein-Protein-]], [[Protein-DNA-Interaktion|Protein-DNA-]]<ref>K. R. Rupesh, A. Smith, P. E. Boehmer: ''Ligand induced stabilization of the melting temperature of the HSV-1 single-strand DNA binding protein using the thermal shift assay.'' In: ''Biochemical and biophysical research communications.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Nummer 4, November 2014, {{ISSN|1090-2104}}, {{DOI|10.1016/j.bbrc.2014.10.145}}, PMID 25449284, {{PMC|4254511}}.</ref> und [[Protein-Lipid-Interaktion]]en sowie Interaktionen zwischen Proteinen und [[Niedermolekulare Verbindung|niedermolekularen Verbindungen]].<ref>K. Huynh, C. L. Partch: ''Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.'' In: ''Current protocols in protein science / editorial board, John E. Coligan.. [et al.].'' Band 79, 2015, {{ISSN|1934-3663}}, S.&nbsp;28.9.1–28.9.14, {{DOI|10.1002/0471140864.ps2809s79}}, PMID 25640896.</ref><ref>S. N. Krishna, C. H. Luan, R. K. Mishra, L. Xu, K. A. Scheidt, W. F. Anderson, R. C. Bergan: ''A fluorescence-based thermal shift assay identifies inhibitors of mitogen activated protein kinase kinase 4.'' In: ''PloS one.'' Band 8, Nummer 12, 2013, {{ISSN|1932-6203}}, S.&nbsp;e81504, {{DOI|10.1371/journal.pone.0081504}}, PMID 24339940, {{PMC|3855329}}.</ref>

== Prinzip ==
Die Faltung eines Proteins wird oftmals durch Bindung eines weiteren Moleküls stabilisiert. Die Stabilisierung äußert sich unter anderem durch eine erhöhte Thermostabilität des Proteins, bei der die [[biologische Aktivität]] des Proteins auch bei vergleichsweise höheren Temperaturen erhalten bleibt und die [[Denaturierung (Biochemie)|Denaturierung]] erst bei höheren Temperaturen einsetzt.<ref>[[Daniel E. Koshland]]: ''Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 44, Nummer 2, Februar 1958, {{ISSN|0027-8424}}, S.&nbsp;98–104, PMID 16590179, {{PMC|335371}}.</ref><ref>K. Linderstrøm-Lang, J. A. Schellman: ''Protein structure and enzyme activity''. In: ''The Enzymes'' (1959). Band 1, Heft 2, S. 443–510.</ref>

Die Durchführung des ''Thermal Shift Assays'' erfolgt durch Zugabe von unterschiedlichen [[Verdünnungsstufe]]n eines Bindungspartners. Zwei Messverfahren haben sich dabei durchgesetzt. Zum Einen ein indirektes Verfahren durch Zusatz eines fluoreszenten [[Proteinfarbstoff]]s wie z. B. [[SYPRO Orange]] oder [[1-Anilinonaphthalen-8-sulfonsäure]] (ANS).<ref>J. J. Lavinder, S. B. Hari, B. J. Sullivan, T. J. Magliery: ''High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering.'' In: ''Journal of the American Chemical Society.'' Band 131, Nummer 11, März 2009, {{ISSN|1520-5126}}, S.&nbsp;3794–3795, {{DOI|10.1021/ja8049063}}, PMID 19292479, {{PMC|2701314}}.</ref> Die Versuchsansätze der Verdünnungsstufen und einer [[Negativkontrolle]] werden hierbei in einem [[qPCR|Real-Time-Cycler]] inkubiert, der die Fluoreszenz in den Versuchsansätzen bei zunehmender Temperatur misst. Zum Anderen die direkte Messung der [[intrinsisch]]en [[Fluoreszenz]], der Eigenfluoreszenz, der [[Tryptophan]]e (und in vermindertem Maße der [[Tyrosin]]e), die auf Grund ihrer Polarität vorrangig im Innern einer Proteinstruktur verortet sind. Ein Bindungsereignis hat in der Regel eine Auswirkung auf die Struktur oder Faltung des Proteins, was eine Änderung der Positionen der Tryptophane, bzw. Tyrosine innerhalb der Struktur zur Folge haben kann.<ref>{{Literatur |Autor=Anders O. Magnusson, Anna Szekrenyi, Henk-Jan Joosten, James Finnigan, Simon Charnock |Titel=nanoDSF as screening tool for enzyme libraries and biotechnology development |Sammelwerk=The FEBS Journal |Band=286 |Nummer=1 |Datum=2019 |ISSN=1742-4658 |DOI=10.1111/febs.14696 |Seiten=184–204 }}</ref> Solch eine Positionsänderung verursacht eine Änderung der Fluoreszenz, welche durch die Änderung der Umgebungsbedingungen ([[Hydratation]], [[Elektronendichte]]) begründet ist. Besonders deutlich wird dieser Effekt, wenn ein Tryptophan oder Tyrosin an dem Bindungsereignis beteiligt ist. Dadurch erhält man in vielen Fällen zusätzlich zur thermischen Stabilisierung noch Informationen zu strukturellen Änderungen während eines Bindungsvorganges.

Eine Variante der Methode namens CETSA (''cellular thermal shift assay'') verwendet [[Zellkultur]]en anstatt gereinigter Proteine, wodurch der erste Versuchsabschnitt, die Bindung eines Bindungspartners an ein Protein, ''[[in vivo]]'' erfolgen kann.<ref>D. Martinez Molina, R. Jafari, M. Ignatushchenko, T. Seki, E. A. Larsson, C. Dan, L. Sreekumar, Y. Cao, P. Nordlund: ''Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.'' In: ''Science.'' Band 341, Nummer 6141, Juli 2013, {{ISSN|1095-9203}}, S.&nbsp;84–87, {{DOI|10.1126/science.1233606}}, PMID 23828940.</ref><ref>R. Jafari, H. Almqvist, H. Axelsson, M. Ignatushchenko, T. Lundbäck, P. Nordlund, D. Martinez Molina: ''The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.'' In: ''Nature protocols.'' Band 9, Nummer 9, September 2014, {{ISSN|1750-2799}}, S.&nbsp;2100–2122, {{DOI|10.1038/nprot.2014.138}}, PMID 25101824.</ref> Die bei der Denaturierung verwendeten [[Puffer (Chemie)|Puffer]] beeinflussen die Änderung der Thermostabilität eines Proteins.<ref>L. Reinhard, H. Mayerhofer, A. Geerlof, J. Mueller-Dieckmann, M. S. Weiss: ''Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor.'' In: ''Acta crystallographica. Section F, Structural biology and crystallization communications.'' Band 69, Pt 2 Februar 2013, {{ISSN|1744-3091}}, S.&nbsp;209–214, {{DOI|10.1107/S1744309112051858}}, PMID 23385769, {{PMC|3564630}}.</ref> Durch den vergleichsweise geringen Materialaufwand eignen sich Thermal Shift Assays für Messungen im [[Hochdurchsatz]].<ref>A. Ciulli, C. Abell: ''Fragment-based approaches to enzyme inhibition.'' In: ''Current Opinion in Biotechnology.'' Band 18, Nummer 6, Dezember 2007, {{ISSN|0958-1669}}, S.&nbsp;489–496, {{DOI|10.1016/j.copbio.2007.09.003}}, PMID 17959370.</ref>

== Anwendungen ==
Thermal Shift Assays werden unter anderem bei der [[Proteincharakterisierung]], beim [[Protein-Engineering]] und beim [[Wirkstoffdesign]] eingesetzt.<ref>J. K. Kranz, C. Schalk-Hihi: ''Protein thermal shifts to identify low molecular weight fragments.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 493, 2011, {{ISSN|1557-7988}}, S.&nbsp;277–298, {{DOI|10.1016/B978-0-12-381274-2.00011-X}}, PMID 21371595.</ref>

Des Weiteren können Thermal Shift Assays genutzt werden, um geeignete Pufferbedingungen für ein Protein zu finden.<ref>{{cite journal |author=Reinhard L.,  Mayerhofer H., Geerlof A., Mueller-Dieckmann J., Weiss M.S. |title=Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. |journal=Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. |volume= 69|issue= 2|pages= 209–214|date=2013-01 |pmid= 23385769 |doi=10.1107/S1744309112051858}}</ref>

Eine verwandte Methode, um optimale Pufferzusammensetzungen für ein Zielprotein oder Biopharmazeutikum zu identifizieren, ist [[nanoDSF]]. nanoDSF misst die Stabilität der Proteinfaltung in thermischen und chemischen Entfaltungsexperimenten. Dabei werden Änderungen der intrinsischen Fluoreszenz von [[Tryptophan]] während der Entfaltung detektiert.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]
[[Kategorie:Biophysikalische Methode]]
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